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16.02.07 / 00:13
Heft 04/2007 Zahnmedizin
Eine In-vitro-Studie

Einfluss von Pepsin auf die Progression von Dentinerosionen

Der vorliegende Beitrag gibt ein Beispiel aus der Grundlagenforschung. Es wird der Einfluss von Pepsin (aus dem Mageninhalt) auf bereits geschädigtes Dentin gemessen und die Wirksamkeit von lokaler Fluoridierung in vitro ermittelt. Diese Arbeit wurde mit dem Wrigley-Propylaxe-Preis 2006 ausgezeichnet.




Neben Personen mit einem hohen Konsum an sauren Lebensmitteln konnen Patienten mit chronischen Refluxerkrankungen [Moazzez et al., 2005; Bartlett et al., 1996] und vor allem mit Essstorungen in Kombination mit Erbrechen [Ohrn et al., 1999; Rytomaa et al., 1998] ganz erhebliche saurebedingte Zahnhartsubstanzdefekte aufweisen, die zum Teil bis weit in das Dentin reichen (Abbildung 1).

Die Ursachen fur endogen bedingte Substanzverluste sind nicht abschliesend geklart. Die einwirkende Magensaure ist mit einem pH-Wert von 1-3 sehr sauer und hat ein hohes erosives Potential. Durch die Salzsaure im Mageninhalt konnen 25-30 Prozent hohere Mineralverluste hervorgerufen werden als durch den Einfluss von Sauren, die in der Nahrung vorkommen, wie etwa Zitronensaure [White et al., 2001].

Erosionen sind im Schmelz ein reines Oberflachenphanomen. Die chronische Einwirkung von Sauren fuhrt zu einem kontinuierlich von ausen nach innen voranschreitenden Mineralverlust. Schnell voranschreitende Substanzverluste konnten daher allein durch die Starke und das erosive Potential der einwirkenden Saure erklart werden. Schreiten die Substanzverluste weiter voran, wird fruher oder spater Dentin exponiert. Dentin besteht nur zu etwa 45 Vol/Prozent aus Mineral und zu etwa 30 Vol/Prozent aus organischen Bestandteilen, hauptsachlich Kollagen. Im Dentin sind Erosionen daher kein reines Oberflachenphanomen. Durch die Sauren wird zwar auch hier der mineralische Anteil herausgelost, aber gleichzeitig werden die organischen Bestandteile freigelegt [Breschi et al., 2002]. Studien haben gezeigt, dass Erosionen mit zunehmender Dicke der organischen Matrix langsamer voranschreiten, da diese Deckschicht eine Art Diffusionsbarriere darstellt [Ganss et al., 2004]. Nach der Entfernung der organischen Deckschicht durch proteolytische Enzyme schreiten Erosionen schneller voran. Die Progression von Dentinerosionen hangt also von der Prasenz der organischen Matrix ab. Aber auch die Wirksamkeit von Fluoridierungsmasnahmen, die in der symptomatischen Therapie von Erosionen Anwendung finden, ist davon abhangig. Nach einer enzymatischen Entfernung der Deckschicht konnten Fluoride keine Wirkung mehr entfalten [Ganss et al., 2004].

Auch der Mageninhalt enthalt proteolytische Enzyme, zum Beispiel Pepsin, die zusammen mit dem Mageninhalt beim Erbrechen oder im Fall eines Reflux in die Mundhohle gelangen und so auf die erosiv veranderten Zahnhartsubstanzen einwirken konnen. Pepsin ist in der Lage, in verschiedenen Geweben, etwa in Bandscheiben [Osebold und Pedrini, 1976] oder Sehnen [Tsuzaki et al., 1993], Kollagen abzubauen. Auch im Dentin kann das Kollagen durch Pepsin degradiert werden [Tonami und Ericson, 2005; Kleter et al., 1997]. Eigene Versuche (unveroffentlicht) konnten zeigen, dass Pepsin auch im erodierten Dentin in der Lage ist, Kollagen abzubauen.

Diese Studien und die klinischen Beobachtungen lassen vermuten, dass Pepsin einen Einfluss auf endogen bedingte, erosive Mineralverluste im Dentin haben konnte. Weiterhin ware es moglich, dass die Pepsindegradation der organischen Strukturen ebenfalls einen negativen Einfluss auf die Wirksamkeit von Fluoridapplikationen zur symptomatischen Therapie von Erosionen hat.

Ziel der vorliegenden in vitro Studie war es daher, den Einfluss der Degradation der organischen Dentinmatrix durch eine Pepsin-Salzsaurelosung auf einen saurebedingten Mineralverlust zu untersuchen. Auserdem sollte untersucht werden, ob Fluoridierungsmasnahmen zur symptomatischen Therapie von Dentinerosionen durch eine vorherige Behandlung mit Pepsin beeinflusst werden.

Material und Methoden

Aus menschlichen, vormals vollstandig retinierten, dritten Molaren wurden Dentinproben mit einer definierten Schichtstarke von 750 μm und einer Oberflache von 10,6 mm2 hergestellt und auf vier Versuchsgruppen mit je 20 Proben aufgeteilt. Die Proben wurden uber neun Tage einem zyklischen De- und Remineralisationsverfahren mit sechs Demineralisationsphasen von je zwei Minuten pro Tag unterworfen. Zusatzlich wurden die Proben zweier Gruppen nach der Demineralisation sechs mal taglich fur jeweils eine Minute mit einer fluoridhaltigen Mundspullosung behandelt (MeridolR Mundspullosung, 250 ppm Fluorid, pH 4,2, GABA, Lorrach, Deutschland). Die Gruppeneinteilung lautete wie folgt:

Gruppe 1: Demineralisation mit einer HCl-Losung (pH 1,6; 0,5Gew.Prozent NaCl)

Gruppe 2: Demineralisation mit einer Pepsin-HCl-Losung (pH 1,6; 0,5 Gew. Prozent NaCl, 1,5 mg/ml Pepsin)

Gruppe 3: Demineralisation mit einer HCl-Losung (pH 1,6; 0,5 Gew. Prozent NaCl), Fluoridierung im Anschluss an die Demineralisation

Gruppe 4: Demineralisation mit einer Pepsin-HCl-Losung (pH 1,6; 0,5 Gew. Prozent NaCl, 1,5 mg/ml Pepsin), Fluoridierung im Anschluss an die Demineralisation

Nach jeder Demineralisation in den Gruppen 1 und 2, sowie nach jeder Fluoridierung in den Gruppen 3 und 4 wurden die Proben fur eine Stunde in einer Remineralisationslosung aufbewahrt [Gerrard und Winter, 1986]. Alle Behandlungen wurden bei 37 °C unter leichtem Schutteln in Sammelgefasen mit 150 ml der jeweiligen Losung durchgefuhrt. Von den Demineralisationslosungen der Gruppen 1 und 2 wurden am Ende eines jeden Versuchstages etwa 10 ml entnommen und bis zur weiteren Analyse eingefroren (-20 °C). Die Veranderung des Mineralgehaltes der Proben wurde mit der longitudinalen Mikroradiographie (LMR) ermittelt [de Josselin de Jong et al., 1988]. Der Mineralstatus wurde an den Versuchstagen 3, 6 und 9 kumulativ als Differenz zum Ausgangswert bestimmt (μm). Der Abbau des Kollagens durch das Pepsin wurde taglich uber den Nachweis von Kollagenabbauprodukten in den Demineralisationslosungen nachgewiesen. Als Mas fur den Kollagenabbau wurde Hydroxyprolin herangezogen, eine fur Kollagen spezifische Aminosaure (Hydroxyprolinanalyse [Woessner, 1961; Stegemann und Stalder, 1967]).

Ergebnisse

In den Losungen der Gruppe 1 liesen sich keine Kollagenabbauprodukte nachweisen. Die Losungen der Gruppe 2 enthielten jedoch an jedem Tag deutliche Mengen an Abbauprodukten (Abbildung 2). Zu Beginn konnten 2,1 μg/ml Hydroxyprolin festgestellt werden, bis zum Versuchsende fiel die Konzentration an Hydroxyprolin jedoch ab (1,3 μg/ml). Der Abbau der organischen Matrix hatte allerdings keinen Einfluss auf die Progression der Mineralverluste (Abbildung 3). In den Gruppen 1 und 2 waren die Mineralverluste an Tag 9 nahezu gleich (Gruppe 1: 61,1}26,7 μm; Gruppe 2: 61,1 } 19,0 μm; n.s.).

Die Fluoridierung (Gruppe 3) konnte den Mineralverlust reduzieren, aber nicht verhindern. An Tag 6 konnte eine Reduktion um 30 Prozent und an Tag 9 um 19 Prozent gemessen werden. Nach der Degradation der organischen Matrix durch Pepsin zeigten die Fluoride keine Wirkung mehr (Gruppe 4), der Mineralverlust an Tag 9 war in Gruppe 4 (62,6}17,1 μm) deutlich hoher als in Gruppe 3 (49,9}15,1 μm; p 0.05) und vergleichbar mit dem in den Gruppen 1 und 2 (n.s.).

Diskussion

Der gewahlte Versuchsaufbau sollte die klinische Situation simulieren, die bei einem Patienten mit einer Essstorung in Kombination mit Erbrechen auftritt. Dazu wurden die physiologischen Bedingungen im Magen nachempfunden (HCl-/NaCl-Losung mit einem pH-Wert von 1,6 und 1,5 mg/ml Pepsin [Newton et al., 2004]). Wie Gesprache mit Bulimiepatienten gezeigt haben, ist ein sechsmaliges Erbrechen pro Tag keine Seltenheit, daher wurden sechs Demineralisationsphasen pro Tag gewahlt. Die Dauer der Saureexposition entsprach etwa der Zeit, die zur Neutralisation von Sauren durch den Speichel in der Mundhohle benotigt wird. Die Dauer einer einzelnen Anwendung der fluoridhaltigen Mundspullosung entsprach den Empfehlungen des Herstellers. Wie erwartet, konnte ein deutlicher Mineralverlust nach alleiniger Salzsaureeinwirkung gemessen werden. Und interessanterweise wurden durch die Einwirkung von Pepsin auch tatsachlich erhebliche Mengen an Kollagen abgebaut. Es hatte jedoch erwartet werden konnen, dass durch die Behandlung mit Pepsin der Substanzverlust ansteigt, zumal in Studien gezeigt werden konnte, dass Pepsin in der Lage ist, Kollagen im erodierten Dentin zu degradieren (eigene Daten unveroffentlicht, [Tonami und Ericson, 2005; Kleter et al., 1997]), und dass eine enzymatische Entfernung der organischen Deckschicht im Dentin zu einer schnelleren Progression eines erosiv bedingten Mineralverlustes fuhrt [Ganss et al., 2004]. Jedoch hatte die Behandlung mit Pepsin keine Steigerung des Mineralverlustes zur Folge. Das liegt vermutlich daran, dass die organische Deckschicht durch das Pepsin nur teilweise entfernt wurde, was in rasterelektronenmikroskopischen Bildern von zusatzlich angefertigten Proben dargestellt werden konnte (Abbildung 4). Die verbliebene Deckschicht scheint auszureichen, um als Diffusionsbarriere zu dienen und um weitere Mineralverluste zu verhindern. Diese ersten Ergebnisse sind jedoch wahrscheinlich nicht einfach auf die Mundsituation zu ubertragen, da die Situation in vivo deutlich komplexer ist als das in dieser Studie verwendete, stark vereinfachte Modell der Mundsituation. Vermutlich wirken dort verschiedene Enzyme, entweder aus dem Mageninhalt, zum Beispiel Trypsin, oder aus dem Speichel zusammen auf die Zahnhartsubstanzen ein, was einen vollstandigeren Abbau der organischen Deckschicht bewirken konnte. Weitere Studien mit dieser Fragestellung konnten Aufschluss daruber geben.

Die Progression von erosiv bedingten Mineralverlusten im Dentin durch Zitronensaure kann in vitro wirksam durch Fluoridierungsmasnahmen, etwa die Anwendung fluoridhaltiger Mundspullosungen mehrfach pro Tag, verhindert werden [Ganss et al., 2001]. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass durch Salzsaure erzeugte Erosionen unter den gegebenen Versuchsbedingungen ebenfalls reduziert werden konnten. Nach der Einwirkung von Pepsin zeigten Fluoride, im engen Rahmen der Versuchsbedingungen, in vitro keine Wirkung mehr. Das konnte daran liegen, dass die organische Matrix durch das Pepsin strukturell so verandert worden ist, dass Fluoride nicht mehr ihre Wirkung entfalten konnen, wie in einer unveranderten Matrix. Es ist jedoch ungeklart, wie sich Pepsin unter klinischen Bedingungen verhalt und wie lange Pepsin nach dem Erbrechen tatsachlich auf die Zahne im Mund einwirkt. Eventuell sind Fluoridierungsmasnahmen bei haufigerer Anwendung oder langerer Einwirkzeit dennoch wirksam. Die klinischen Erfahrungen mit einer intensiven Fluoridierung bei Patienten mit einer Essstorung sind jedoch durchaus positiv, so dass Fluoridierungsempfehlungen auch bei endogen bedingten Erosionen weiterhin gegeben werden sollten. Ob Strategien zur Enzymhemmung sinnvoll sind, mussen weitere Studien zu diesem Thema zeigen.

Zusammenfassung

Pepsin ist in der Lage, die organischen Strukturen im erodierten Dentin teilweise abzubauen. Dieser Abbau hat jedoch keinen Einfluss auf einen erosiv bedingten Mineralverlust. Nach der Einwirkung von Pepsin zeigen Fluoridierungsmasnahmen zur symptomatischen Therapie von Erosionen zumindest unter den gegebenen Versuchsbedingungen keine Wirkung mehr. Dennoch sollten Fluoridierungsempfehlungen aufrechterhalten werden, da Fluoridierungsmasnahmen bei Patienten mit Bulimie in der klinischen Praxis gute Ergebnisse zeigen und es bislang noch keine In-vivo-Studien uber die Wirkung von Pepsin auf Zahnhartsubstanzen gibt.

Dr. Nadine Schlüter
PD Dr. Carolina Ganß
Prof. Dr. Joachim Klimek
Zentrum für ZMK
Poliklinik für Zahnerhaltungskunde und
Präventive Zahnheilkunde
Schlangenzahl 14, 35392 Gießen
nadine.schlueter@dentist.med.uni-giessen.de



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