Möglichkeiten und Grenzen mikrobiologischer und molekularer Nachweisverfahren

Die endodontische Infektion ist im Wesentlichen eine Infektion des Pulpasystems und die primär ätiologische Ursache der verschiedenen Formen periradikulärer Entzündungsreaktionen [Kakehashi et al., 1965; Sundqvist, 1976]. Infolge einer traumatischen Pulpaexposition oder einer kariösen Läsion des Zahnes kommt es immer zur Invasion von Mikroorganismen aus der Mundhöhle in den Wurzelkanal [Tronstad und Sunde, 2003]. Dieser bietet hervorragende Bedingungen zur mikrobiellen Kolonisation und ist zudem weitgehend vor der Immunabwehr des Wirtes geschützt. Nachdem die endodontische Infektion etabliert ist, treten Mikroorganismen beziehungsweise deren Mediatoren über das Foramen apicale, akzessorische Kanäle und Dentintubuli in Kontakt zu periradikulären Geweben und führen zu entzündlichen Veränderungen. Periradikuläre Parodontitiden gehören zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen [Eriksen et al., 2002; Figdor, 2002]. Traditionell werden die im infizierten Endodont beteiligten Bakterien durch kulturbasierte Techniken untersucht, welche auf der Isolation, dem Wachstum und der Identifizierung durch Morphologie und biochemische Tests basieren. Die Kultur und andere klassische Identifizierungsmethoden haben jedoch einige Limitationen in der mikrobiellen Diagnostik [Rolph et al., 2001; Munson et al., 2002]. Exemplarisch für die neueste Generation der diagnostischen Verfahren wird in diesem Artikel auf die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) eingegangen. Tatsächlich konnten die Erkenntnisse kulturbasierter Methoden durch molekularbiologische Techniken ergänzt und signifikant erweitert werden [Siqueira und Rôças, 2005] (Tabelle 1).

Seit inzwischen mehr als einem Jahrhundert sind Bakterienkulturverfahren der Standard in der Diagnostik von Infektionskrankheiten.

Eine erfolgreiche Kultivierung unter Laborbedingungen setzt allerdings die Kenntnis der spezifischen Wachstumsfaktoren und -anforderungen der Bakterien voraus, welche jedoch nur auf einen geringen Anteil der Mikroorganismen limitiert ist. Eine große Anzahl bakterieller Spezies lässt sich im Labor nur sehr schwer oder gar nicht anzüchten.

Der Hauptvorteil von Kulturverfahren ist ihre Vielseitigkeit, weil sie die Identifizierung einer großen Vielfalt mikrobieller Spezies (gesuchte und ungesuchte) einer Probe erlaubt. Weiterhin ermöglicht sie die Erstellung von Resistenzprofilen der Isolate und die Beobachtung ihrer Physiologie und Pathogenität.

Allerdings haben die kulturbasierten Identifizierungs- Methoden auch Nachteile – sie sind kostspielig, zeitintensiv und aufwendig. Sie haben sehr geringe Sensitivität, und auch die Spezifität (Abbildung 1) kann, beeinflusst durch die Erfahrung des Untersuchenden, gering sein. Zudem stehen die Ergebnisse nicht zuletzt in starker Abhängigkeit von Probeentnahmetechnik, Transport und -medium. Schließlich machen die große Anzahl nicht kultivierbarer bakterieller Spezies sowie die Schwierigkeiten bei der Identifizierung vieler kultivierbarer Spezies den Hauptnachteil der kulturbasierten Methoden aus.

Es gibt viele mögliche Ursachen dafür, dass Bakterien nicht kultivierbar sind [Kell und Young, 2000; Wade, 2002 und 2004]. Es ist offensichtlich, dass Mikroorganismen, die nicht kultiviert werden können, nicht mit phänotyp-basierten Methoden identifiziert werden können. Solange die Wachstumsbedürfnisse der meisten Bakterien unbekannt sind, bedarf es Identifizierungsmethoden, die nicht auf der Bakterienkultur basieren. Dies würde verhindern, dass so viele pathogene Bakterien die mikrobiologische Analyse der klinischen Proben unerkannt passieren.

Die korrekte Identifizierung mikrobieller Isolate ist in der klinischen Mikrobiologie von höchster Bedeutung. Um eine bestimmte Spezies anhand ihrer phänotypischen Eigenschaften identifizieren zu können, muss diese kultiviert werden können. Aber auch bei erfolgreicher Kultivierung eines Mikroorganismus kann die Identifizierung in einigen Fällen erfolglos bleiben. Außerdem steht die Qualität der Ergebnisse immer in Abhängigkeit von subjektiver Beurteilung und individueller Erfahrung.

Bei langsam wachsenden und anspruchsvollen Bakterien ist die klassische phänotypische Identifizierung schwierig und zeitintensiv. Nach wie vor sind Divergenz und Konvergenz (Abbildung 2) Hauptprobleme der auf phänotypischen Eigenschaften basierenden mikrobiellen Identifizierung. Als divergent bezeichnet man genetisch ähnliche Stämme der gleichen Spezies, welche sich aber phänotypisch unterschiedlich entwickelt haben. Konvergente Stämme haben trotz genetischer Unterschiede ein ähnliches phänotypisches Verhalten entwickelt [Tanner et al., 1992]. In beiden Fällen, können phänotyp-basierte diagnostische Tests zur Fehlinterpretation führen.

Insbesondere hier können die molekularbiologischen Verfahren, wie die Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenzierung, die ursprünglich zur Identifizierung unkultivierbarer Bakterien gedacht war, eine Erhöhung der Qualität der Ergebnisse initiieren. Im Gegensatz zur phänotypischen Identifizierung bietet die Sequenzierung sogar bei seltenen Isolaten eindeutige Ergebnisse.

Molekulardiagnostische Methoden haben hinsichtlich der mikrobiellen Identifizierung gegenüber anderen Methoden verschiedene Vorteile:

• Nachweis sowohl kultivierbarer als auch unkultivierbarer Spezies

• hohe Sensitivität und Spezifität

• direkter Nachweis bakterieller Spezies ohne Bakterienkultur

• schnell und wenig aufwendig

• einfache Probenentnahme (Abbildung 3) und Transport

• während antimikrobieller Therapie einsetzbar

• zeitlich flexible Probenaufbereitung und -lagerung.

Es gibt eine Vielzahl molekularer Methoden zur Untersuchung von Mikroorganismen, dabei hängt die Wahl eines bestimmten Verfahrens sehr stark von der Zielsetzung ab. Exemplarisch für die molekularbiologischen Methoden wird nachfolgend die PCR vorgestellt.

Die PCR Methode (Polymerase-Kettenreaktion) basiert auf einer Vervielfältigung von DNA durch wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primer-Annealing und Primer-Extension (Abbildung 4). Zunächst wird die DNA erhitzt (Denaturierung), um die Wasserstoffbrückenbindungen, die die Doppelstränge zusammenhalten, aufzubrechen. Nach Freisetzung der beiden Einzelstränge wird die Temperatur gesenkt, und zwei kurze komplementäre Oligonukleotide (Primer) werden an entgegengesetzten Abschnitten der DNA-Stränge angelagert (Primer-Annealing), um den zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt zu definieren. Ausgehend von den Primern werden die Template- DNA mithilfe einer thermostabilen Polymerase und in Anwesenheit von einzelnen DNA-Nukleotiden ein komplementärer zweiter DNA-Abschnitt synthetisiert (Primer- Extension). Die Produkte dienen als Vorlage für neue Reaktionen in jedem nachfolgenden Zyklus. Das Ergebnis ist eine exponentielle Vervielfältigung neuer DNA und resultiert in einer außergewöhnlichen Sensitivität (zehn bis hundertfach sensitiver als andere Verfahren) im Nachweis der DNA. Seit ihrer Einführung sind zahlreiche Varianten der PCR-Technologie entwickelt worden. Konventionelle PCR-Verfahren sind qualitativ oder können modifiziert werden, um semiquantitativ zu sein. Eine Ausnahme ist die Real-Time PCR, welche eine Quantifizierung der amplifizierten PCR-Produkte während des Reaktionsablaufs erlaubt.

Die molekularen Techniken werden eingesetzt, um die Nachteile der Kulturverfahren zu überwinden. Dennoch sind auch sie nicht ohne Limitationen, obwohl viele durch Variieren der Technik umgangen werden können.

Die Fähigkeit der PCR, sowohl kleinste Mengen von Zellen als auch tote Zellen nachzuweisen, ist für die Interpretation der Ergebnisse endodontischer Forschung von speziellem Interesse.

Insbesondere werden hierbei diskutiert:

• zu hohe Sensitivität

• tote Zellen

• humane DNA.

Die hohe Nachweisrate der PCR könnte insbesondere bei nicht quantitativen Untersuchungen von Interesse sein. Aufgrund des Nachweises kleinster Mengen von Zellen einer bestimmten mikrobiellen Spezies stellt sich die Frage, ob die generierten Ergebnisse in Hinblick auf die Erkrankungsursache signifikant sind. Dennoch hat dieses hoch sensitive Identifizierungsverfahren große Vorteile in der endodontischen Forschung, da physikalische Bedingungen des Wurzelkanalsystems und Limitationen der Probenentnahmetechnik die Entnahme einer repräsentativen Probe erschweren [Siqueira und Rôças, 2004]. Werden Zellen einer bestimmten Spezies unterhalb der Detektionsgrenze eines diagnostischen Tests entnommen, wird dadurch die Prävalenz der Spezies unterschätzt. Auch gilt es, die für die spezifische Probe benötigte analytische Sensitivität zu berücksichtigen. Es gibt keinen eindeutigen Hinweis darauf, wie hoch die mikrobielle Last zur Induzierung einer periradikulären Läsion ist. Eine Korrelation zwischen der absoluten Anzahl der Mikroorganismen im infizierten Wurzelkanal und der Schwere der Erkrankung wird mit dieser Aussage zur Diskussion gestellt.

Der Nachweis toter Zellen durch ein bestimmtes Identifizierungsverfahren kann zur gleichen Zeit ein Vorteil und ein Nachteil der Methode sein. Einerseits erlaubt diese Fähigkeit den Nachweis von unkultivierbaren oder anspruchsvollen Bakterien, die während der Probenentnahme, dem Transport oder der Isolationsprozeduren absterben könnten [Siqueira und Rôças, 2003], andererseits könnte der Nachweis von Bakterien, die bereits am Infektionsort tot waren, zu einer falschen Annahme ihrer Rolle im Infektionsverlauf führen.

Beim Entwurf von Primern wird nach Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien gesucht [Nadkarni et al., 2002]. Bisher wenig Beachtung findet die Möglichkeit, dass Primer unspezifische Reaktionen mit der humanen DNA eingehen können [Navarro et al., 2002]. Als Konsequenz kann es zu einem Verlust an Sensitivität und Spezifität kommen [Disqué, 2007]. Techniken zur Reduktion humaner DNA bedeuten einen Kompromiss zwischen Reinheit und Verlust bakterieller DNA. Die Effizienz dieser Techniken hängt weiterhin vom Probentyp, dass heißt der involvierten Mikroflora ab. In Abhängigkeit der verschiedenen Isolierungsprinzipien resultieren Limitationen, wie eine reduzierte Nachweiskapazität gramnegativer oder zellwandloser Bakterien oder eine ungleiche Entfernung humaner DNA [Horz et al., 2008].

Die Bakterienkultur hat einen großen Beitrag zur Aufklärung der endodontischen Infektion geleistet. Dennoch haben molekulare Verfahren gegenüber der Kultur diverse Vorteile beim Nachweis und der Identifizierung von Mikroorganismen. Molekulare Methoden, insbesondere die PCR, sind spezifischer, sensitiver und schneller als die Kultur und können unkultivierbare und anspruchsvolle Organismen nachweisen. Zudem erlauben sie eine präzisere Identifizierung kultivierbarer bakterieller Stämme mit phänotypisch unterschiedlichen Eigenschaften, können verlässlich während antimikrobieller Therapie eingesetzt werden und brauchen keine lebensfähigen Mikroorganismen, was insbesondere beim Nachweis von anaeroben Bakterien von Vorteil ist, da diese möglicherweise den Transport oder die Bearbeitung der Proben nicht überleben. PCR-Verfahren haben durch das Erkennen von mutmaßlich endodontischen Pathogenen und der Erhärtung des Zusammenhangs zwischen einigen kultivierbaren aber anspruchsvollen anaeroben Bakterien mit Wurzelkanalinfektionen signifikant zum Wissen um die Wurzelkanalmikroflora beigetragen. Ohne Zweifel wird ein gezielter Gebrauch dieser Methoden zusätzliche wertvolle Informationen zur Identifizierung und zum Verständnis kausaler Faktoren von endodontischen Infektionen liefern und zur Entwicklung verbesserter therapeutischer Strategien beitragen.

Bei der Untersuchung der Pathogenität einzelner Spezies ist man trotz stetiger Weiterentwicklung molekularer Verfahren nach wie vor auf die Kultivierung von Mikroorganismen angewiesen [Spratt, 2004]. Andererseits zeigen molekulare Untersuchungsmethoden, dass 40 bis 50 Prozent der oralen Mikroflora (Abbildung 5) momentan nicht kultivierbar sind.

Ein zukünftiger Einsatz kommerzieller mikrobiologischer Tests – wie bereits in der Parodontologie üblich (Abbildung 6) – zur optimierten Diagnostik und Therapie in der Endodontie setzt die weitere Erforschung der Pathogenese endodontischer Infektionen voraus.

In der Endodontie fehlt bislang eine Festlegung auf Leitkeime, die für die Parodontologie bereits definiert scheinen [Socransky et al., 1998; Beikler et al., 2005]. Tatsächlich werden Parallelen in der Mikroflora parodontaler und endodontischer Infektionen beschrieben [Tronstad et al., 2003; Saito et al., 2006].

Für den Praktiker bedeutet dies, dass sowohl mikro- als auch molekularbiologische Verfahren, wie die PCR, Hoffnung auf ein besseres Verständnis ätiopathologisch relevanter Mechanismen endodontischer Erkrankungen machen.

Dr. Alexandra Petersen

Prof. Dr. Detlef Heidemann

Poliklinik für Zahnerhaltungskunde

Zentrum der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

(Carolinum)

Klinikum der J.W. Goethe-Universität

Theodor-Stern-Kai 7

60590 Frankfurt am Main

Petersen@med.uni-frankfurt.de

Gramnegative Spezies

Prevotella

Porphyromonas

Fusobacterium

Tanerella

Treponema

Grampositive Spezies

Actinomyces

Eubakterium

Peptostreptococcus

Propionibakterium

Streptococcus